De diagnose van Lyme borreliose berust vooral op de aanwezigheid van ziekteverschijnselen in de context van een mogelijke blootstelling aan een tekenbeet (ook al is er geen herinnering aan een tekenbeet), zoals een wandeling in het bos of blootstelling in de tuin. Het blootstellingsrisico en duidelijke symptomen zoals het erythema migrans volstaan om een diagnose te stellen en de behandeling te starten.
In twijfelgevallen of ernstige gevallen wordt een laboratoriumtest aangevraagd. De serologie (opsporing van antilichamen) is de opsporingstest die de voorkeur geniet. In geval van een positief of twijfelachtig resultaat wordt een bevestigingstest uitgevoerd (Western blot). Testen die de ziekteverwekker zelf opsporen (microscopisch onderzoek, cultuur, moleculaire biologie) kunnen in bepaalde situaties worden gebruikt maar zijn slechts in enkele gespecialiseerde laboratoria voorhanden en zijn vaak onvoldoende gevoelig.